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张焕海 潍坊检验检疫局 261041
摘要：本文介绍了啤酒中的有害微生物的种类、来源、有害微生物对啤酒品质的影响。并简单介绍了乳酸菌、乳杆菌、足球菌、发酵单胞菌、果胶杆菌、巨球菌等几种啤酒有害微生物。
关键词：啤酒、有害微生物、酸败、HACCP
The harmful fungus which should be considered
when the HACCP System of brewery be established
Abstract: This article introduced the influence of kinds, source of harmful microorganism to the quality of beer. In addition, it also introduced some types of harmful microorganism. For example, Lactic Acid Bacteria, Lactobacillus, Pediococcus, Zymomonas, Pectinatus, Megasphaera and so on.
Key Words: beer, harmful microorganism, rancidity
我国现有五百余家啤酒厂,都有不同程度的厌氧菌或野生酵母污染现象的存在,有的出现异常发酵,有的造成啤酒混浊、酸败有异杂腐败气味等,严重影响了产量质量。
啤酒作为纯粹培养物发酵的产物,保持纯正清爽是最为重要的,啤酒生产过程,许多环节都可能成为有害微生物污染入侵的入口,它们的污染繁殖由于产生与正常培养酵母不同的异味而影响啤酒的风味和稳定性,甚至使之败坏。现在许多啤酒厂按照HACCP的七个原理建立了HACCP管理体系，但是没有分清楚啤酒中的有害微生物，所以进行的危害分析不到位，本文简单介绍一下啤酒中的有害微生物，以供在危害分析时加以参考。
一、啤酒有害微生物
啤酒有害微生物是从原料、用水、空气、酵母、空容器及工作人员带来的,存在于大桶管路、车间的墙面、地面排水沟等各处。其定义为:除了啤酒酿造所必须的微生物即啤酒酵母(培养酵母)以外在啤酒厂被检出的微生物都被视为污染微生物。而这些微生物当中能使啤酒风味及稳定性劣化的叫做啤酒有害微生物。到目前为止报道的啤酒污染细菌大都不是对人致病菌,只有一个例外,从市售混浊的啤酒中分离出的Peednillium crustostosum(足球菌的一种)可以产生毒性很强的生物碱,对人体能产生严重病变。
啤酒生产中造成有害的污染菌,最有害的四种microorganism是乳酸杆菌、足球菌、果胶杆菌、野生酵母。用营养琼脂测细菌总数,用乳糖培养基测大肠菌群,它们只能检测卫生状况,并没有分出啤酒的无害微生物和有害微生物。而上述厌氧菌则可使啤酒损坏,所以真正对啤酒构成危害的细菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌和革兰氏阴性严格厌氧菌及野生酵母。对于非热处理啤酒,即没有巴氏杀菌工艺,所以啤酒酵母在滤过后也被列入有害微生物名单上。
按照污染细菌对啤酒生产的危害程度,可将啤酒酿造中常见的污染细菌分为啤酒有害微生物、啤酒间接有害微生物、潜在啤酒有害微生物。.
啤酒有害菌：此类菌在各种啤酒中有生长产生危害,并能通过多种途径传播,主要是革兰氏阳性的乳酸菌类,革兰氏阴性的果胶杆菌和巨球菌等及野生酵母。
啤酒间接有害微生物(或叫无害微生物)：此类微生物具有腐败性质,但它们不能在正常的啤酒中生长,故可看作对啤酒无直接害处,例如芽抱杆菌对酒花物质非常敏感,以致不能在啤酒中生长,但它们能形成耐热的孢子,遗留在啤酒中。霉菌是需氧菌也不能在啤酒中生长,但能在原 料、容器、包装材料上生长成菌落,产生霉昧,间接传到啤酒中,影响啤酒质量。,
啤酒潜在有害微生物 ：此类菌是在一定条件下危害啤酒的细菌,包括链球菌、明串珠菌、乳链球菌、克氏小球菌等。当工艺控制出现不正常,啤酒中控制因素降低时,潜在有害菌才生长,特别是在以下情况下：PH值>4.5、氧含量>1mg/L、过低的苦味质低于20EBC单位、过高的发酵度与最终发酵度的差别(大于1%)、糖化不好等。我们重点需要讨论的是啤酒有害菌。
二、.啤酒有害微生物的由来
在啤酒生产上的有害微生物,一般讲是随原料、用水、空气、酵母泥、空容器及操作人员带来的,存在于大桶,管路设备及建筑物的每个角落。
(1)大麦和麦芽
大麦、麦芽里附着霉茵、细菌、野生酵母,酿造用水中也有各种细菌、野生酵母的存在。在糖化由于麦汁煮沸的进行,这些微生物是无法生还的。但必须注意洗刷用水的卫生。
(2)空气
空气中漂浮着霉菌、细菌、野生酵母。尤其是用于麦汁与啤酒接触的空气、压缩空气。微生物的状况要十分注意。
(3)添加酵母
啤酒酵母在酿造过程一直是存在的,主发酵后沉淀的酵母经水洗为下次发酵所用,这种添加酵母经�；嵊邢妇�、野生酵母的存在。
(4)空容器
回收的空瓶、空生啤罐及回转箱等由于野生酵母、霉菌的污染被认为是危险的微生物污染源。
(5)操作人员 在人们的身上生存着大肠菌群的细菌、野生酵母、霉菌等各种微生物,这就如同我们的手污染食品一样。 另外,操作人员的衣服、鞋、帽也有微生物的存在而带入工作场所。
可以通过建立卫生标准操作程序（SSOP）进行控制以上微生物传播的途径。
三、.啤酒有害微生物与啤酒品质的关系
啤酒有害微生物对啤酒的影响主要表现在使啤酒混浊、香味的劣化,粘着性及喷涌现象等。
(1)微生物混浊
大家知道,啤酒是低PH值(4.1一4.3)二氧化碳饱和的嫌气状态,另外,由于酵母的增殖发酵,营养素的消耗处于相对低营养状态,再加上酒花树脂对革兰氏阳性的抗菌作用等,可以说,不太适合于一般微生物的生长。但是Saccharomyces属的野生酵母,啤酒乳酸菌、Pectinatus cerevisiiphilus属的嫌气性革兰氏阴性菌等在成品啤酒中也能增殖,并引起微生物混浊。
(2)香味的劣化或变质
由于麦汁污染了有害微生物,啤酒〈包括发酵液〉的原味发生改变,成品啤酒的香味产生重大影响。乳酸菌由于乳酸发酵的代谢产物,使啤酒产生酸味及其转化的双乙酰等物质的味道。
(3)粘着性
对于使啤酒带有粘着性,啤酒乳酸菌、醋酸菌都有发现,常见的是乳酸球菌,醋酸菌因是好气性菌,在桶酒内好气条件下容易生长。
（4）喷涌
瓶啤酒〈或听啤酒〉在开盖时瞬间,性地发泡,啤酒从瓶口喷出的现象叫喷涌。大麦在收获时多雨或贮藏条件不良,会使啤酒产生喷涌,经过对农场及贮藏过程附着的霉菌进行研究发现有关系,F1Isari11m属、Penicillium属等较广范围内的霉菌可能产生喷涌性物质。
四、麦芽生产过程中微生物与啤酒品质的关系
大麦和麦芽污染微生物对啤酒的影响最常见的情况是降低了啤酒的气体稳定性,即引起喷洒。喷酒的主要原因是使用了凉干大麦或贮存不当的大麦。在浸麦过程中,给大麦接种上各种污染微生物,然后检查用不同种微生物污染的麦芽制成 的啤酒,发现引起喷洒的菌主要是Fusaria。接种污染后,都能导致麦汁和啤酒中麦汁氮和甲醒氮的增加,就常引起喷洒。
在对喷酒原因的调查中发现一个Fusari11m的分离菌能够产生至少两种喷洒诱导物,其中的一种是含肤的低分子物质。在培养滤液中和被这种菌污染的谷粒上也能分离出一种能够引起喷酒的多肤,研究人员发现,能够引起正常啤酒强烈喷洒的纯净诱导物的浓度至少应为0.05ppm。
五、.啤酒有害微生物
根据细菌和革兰氏染液的不同染色反应,传统上可以把它们分为两类。一些细菌的细胞外有一层相对较厚的单层的肽葡聚糖,这是一层由微小颗粒组成的网状结构,它能够给细胞提供一种结构上的支持力。这些细菌若用革兰氏复合染液结晶紫/腆染色,并用酒精或丙酮冲洗后可以着色,这些细菌称为革兰氏阳性菌,它们在显微镜下呈现为紫色。而革兰氏阴性菌,细胞外拥有多层的外皮,包括细胞质膜、胞外质、一薄层的肽葡聚糖和一层疏水性的外膜。这些细菌若用革兰氏染液染色,用酒精或丙酮冲洗后不能着色,在显微镜下呈现为粉红色。
(1)乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)
乳酸菌是革兰氏阳性的、不生孢子非运动性的杆菌或球菌。它们有绝对的发酵能力,同化作用的最终产物为乳酸、CO2、醋酸和(或)酒精的混合物(异型发酵),或者只产生单一的乳酸〈同型发酵〉。它们对酸有一定的耐受力并有复杂的营养要求。
糖的代谢：乳酸菌一般来说不能分解多糖,但也有例外,能水解淀粉。大多数的糖通过特定的透性酶被同化,在某些情况下,(如乳糖和半乳糖)糖的同化需要依靠磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的转磷酸酶系统(PTS)。乳酸菌的己糖发酵途径主要有两条,其差异在于采用不同的方式劈开己糖的C6骨架,也就产生了不同的终产物.同型发酵过程中,链球菌、足球菌和一些乳杆菌用二磷酸果糖酶把1,6一二磷酸果糖分成两个磷酸丙糖,再通过丙酣酸形成乳酸。乳酸菌既能产生D〈-〉也能产生L(+)乳酸,在某些情况下也能同时产生这两种旋光异构物。 乳酸菌对丙翻酸的异化作用,还有两条比较次耍的途径,但这所谓的次要途径对啤酒酿造者来说也是颇为重要的,在其过程中可产生一些挥发性物质如丁二酮等。
氮的代谢 ：乳酸菌是一种典型的需要复杂营养条件(不能在合成培养基上生长)的菌,它们的生长需要多种氨基酸和维生素。乳酸菌的蛋白分解能力较弱,但在多数情况下,它们需求的氨基酸还是由蛋白酶的活动供给的。有证明表明在乳杆菌中有表面结合肤酶,这些研究和啤酒的关系是比较大的,因为啤酒中缺乏各种氨基酸,一般认为这一点正是限制有害的乳杆菌在啤酒中生长的重要因素。
氧的需求：乳酸菌和氧之间被认为是一也耐氧的厌氧菌,即它们不能利用氧气,但也不象严格厌氧菌会被氧气杀死。人们一般认为,当细菌暴露在空气中和超氧化物等,需氧的细菌有一套酶如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶,可以分别将这些基因转移。严格厌氧菌没有这些酶,所以不能在有氧环境中生存。乳酸菌因为不能制造血红素,所以也不能合成过氧化氢酶。但是应该说乳酸菌毕竟是一种厌氧菌,在培养实验特别是初始的分离实验中,应该让它们在厌氧或部分厌氧的条件下生长。
(2)乳杆菌(Lactobacillus)
在啤酒和啤酒厂中至少可检出9个种的乳杆菌菌株,乳杆菌的生长几乎总能导致啤酒的损坏,即使发现有微量乳杆菌的存在,也应该立即把它们清除出去。因为,不同种的乳杆菌会不断改变它们在啤酒中的生长能力和对酒花苦味质的耐受力。把乳杆菌接种到啤酒中,随着菌的生长不断检验啤酒中糖和氨基酸含量的变化,就可以了解乳杆菌在啤酒中生长所需的营养素。乳杆菌在啤酒中的生长,不仅取决于啤酒的类型,也取决于乳杆菌的种类。
乳杆菌对啤酒质量的影响：在啤酒制造的后发酵阶段以及包装后的成品啤酒中,乳杆菌的存在是最危险的。啤酒变质的特征是产生一种‘丝状混浊’,但在混浊前啤酒首先会发出双乙酰的味。乳酸在啤酒中的风味阈值太高,达300PPm。而双乙酰的风味阈值较低,约为0.15PPm,这就使双乙酰替代乳酸,成为啤酒受乳杆菌污染变质的一种强列风味物质。啤酒在没有酵母的情况下,只要受到极少量的乳杆菌的污染,就会积聚高浓度的双乙酰。一些乳杆菌还能产生孢外多糖和‘丝状粘质’,但实际上啤酒中的多糖类丝状粘质和乳杆菌关系不大,而经常和足球菌和醋酸菌有关。
(3)足球菌（Pediococcus)
足球菌是同型发酵的球菌,在外观上常常成双或4个,通过两个平面分裂。足球菌是典型的过氧化氢酶阴性菌,足球菌具有特殊的 ‘四联’结构。
习惯上认为足球菌对啤酒的污染常常引起产酸并产生双乙酰的奶油气味。有证据表明足球菌生成双乙酰的途径和乳杆菌合成双乙酰的的途径是一致的,但合成的量却随种的不同而不同。能使悬浮液中的酵母数下降至正常的30%,并在啤酒中产生大量的双乙酰,相对来说, P.diococcus污染积聚 的双乙酰要更多一些。 啤酒产生丝状混浊和足球菌有关。但取决于一些可发酵糖的存在。这些由足球菌产生的孢外粘液是可摇溶的,是一种含有葡萄糖、甘露糖和核酸的复杂的杂聚物。
(4)发酵单胞菌〈Zymomonas〉
发障单胞菌是细胞呈短粗型的革兰氏阴性的杆菌；1.0~ 1.4μm×2.0~6.0μm。常成双成对、但单个的细胞也常出现；不产生内生孢子。大多数菌株是不运动的,运动的菌株则具1 ~4根极生鞭毛。葡萄糖和果糖发酵可产生近等克分子量的乙醇,和CO2,同时还生成少量的乙醛、乙酸、乳酸和甘油。不能发酵麦芽糖;过氧化氢酶阴性且厌氧,但能耐受一些氧气。在营养琼脂培养基上不能生长。在PH3.5一7.5能够生存,而且耐酒花苦味,酒精耐受低于6%〈体积〉。发酵单细胞菌的 ,G+C含量为47.5~49.5mol%。
对啤酒的污染 ：研究表明发酵单孢菌污染可在包装啤酒中产生硫化氢和乙腔,另外,还能产生痕量的二甲基硫和二甲基二硫。发酵单 抱菌是上面发酵啤酒厂中一种重要的污染菌。 在下面发酵啤酒厂中,还没有发酵单抱菌污染的报道。它们有相对水平较高的碳水化合物需求,使它们局限在上面发酵的啤酒厂。但是,也不能忽视它们在下面发酵啤酒厂中出现的可能性。只是下面发酵较低的发酵温度 (9~12℃)不适于发酵单孢菌的生长。
(5)果胶杆菌〈Pectinatus〉
Pectinatus是革兰氏阴性、过氧化氢酶阴性的严格厌氧菌。它首先是从美国的包装啤酒中分离出的,然后,又从损坏的德国和芬兰啤酒中分离出。从包装啤酒中分离出了同样的厌氧杆菌。
P.cezevisiiphilus是细胞略呈孤形的杆菌,0.7~0.8μm ×2.0~32μm,末端钝圆,常成单或成双,极少的情况也呈短链状,较老的细胞趋向于形成螺旋,外观呈球形,可依靠端生鞭毛运动;因为是严格厌氧菌,在有氧或二氧化碳气条件下的琼脂培养基上不能生长,但却可在硫代乙醇酸盐琼脂培养基上生长;可利用乳酸盐产生乙酸、丙醇、丁二酸、乳酸和CO2; DNA的G+C含量为39.8mol%。
对啤酒的污染 ：Pectinatus可在麦汁和包装啤酒中产生大量的乙酸、丙酸和3一羟基丁酮。在被Pectinatus污染的啤酒中还可检出高浓度的H2S,啤酒出现混浊,并带有一股臭鸡蛋味。
在混有啤酒和水的润滑油中及排水系统中都可分离出Pectinatus的菌株,有关这种菌在啤酒厂中的传播机制还没有搞清。
(6)巨球菌(Megasphaera)
Back从被污染菌污染、出现雾状混浊并带有不愉快异味的啤酒中分离出了专性厌氧的、革兰氏阴性、过氧化氢酶阴性的球菌。这些球菌分离物在表型上和Megasphaera elsdenii类似,但其DNA的G+C值和M·elsdenii却有不同,所以把 它们称为Megasphaera的种I和种II。Megasphaera的污染可在啤酒中产生大量的丁酸,同时产生少量的乙酸、异戊酸及3一羟基丁酮。麦汁受到Measphaera污染后,也会产生大量的丁酸和乙酸及少量的戊酸和异戊酸,但不会产生3一羟基丁酮�？梢匀衔狹egasphaera是一种真正的啤酒污染菌。
〈7〉野生酵母
啤酒生产中的野生酵母有的为酵母属内的酵母,如糖化酵母,还有非酵母属的野生酵母,如汉逊氏酵母属、毕赤氏醇母属、假丝酵母属、球拟酵母属、裂殖酵母属、酒香酵母属、克勒克酵母属等。严格说来,非本厂纯粹培养的酵母都称为野生酵母.显微镜检查不能区别野生酵母和培养酵母,但野生酵母 易形成子囊孢子；耐热性强。
作者：张焕海： 男，工作单位：潍坊检验检疫局，农学士、高级工程师，研究方向：食品安全
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《啤酒厂建立HACCP体系时要考虑的有害微生物》