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菌株分离(separation)就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开,并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选,进而得到所需微生物的过程.菌株分离、筛选(screening)虽为两个环节,但却不能绝然分开,因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用.工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分:一是从自然界分离所需要的菌株,二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别.
在实验工作中,为使筛选达到事半功倍的效果,总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选:
(1)向菌种保藏机构索取有关的菌株,从中筛选所需菌株.
(2)由自然界采集样品,如土壤、水、动植物体等,从中进行分离筛选.
(3)从一些发酵制品中分离目的菌株,如从酱油中分离蛋白酶产生菌,从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等.该类发酵制品经过长期的自然选择,具有悠久的历史,从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株.
菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤.
自然界含菌样品极其丰富,土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物,种类数量十分可观.但总体来讲土壤样品的含菌量最多.
一、从土壤中采样
土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分,是微生物最集中的地方.从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株,空气、水中的微生物也都来源于土壤,所以土壤样品往往是首选的采集目标.一般情况下,土壤中含细菌数量最多,且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律:细菌(108)>放线菌(107)>霉菌(106)>酵母菌(105)>藻类(104)>原生动物(103),其中放线菌和霉菌指其孢子数.但各种微生物由于生理特性不同,在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化.因此,在分离菌株前要根据分离筛选的目的,到相应的环境和地区去采集样品.
(一)根据土壤特点
1. 土壤有机质含量和通气状况
一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富,营养充足,且土壤成团粒结构,通气饱水性能好,因而,微生物生长旺盛,数量多,尤其适合于细菌、放线菌生长.山坡上的森林土,植被厚,枯枝落叶多,有机质丰富,且阴暗潮湿,适合霉菌、酵母菌生长繁殖,微生物数量相应也比较少.
从土层的纵剖面看,1～5cm的表层土由于阳光照射,蒸发量大,水分少,且有紫外线的杀菌作用,因而微生物数量比5～25cm土层少;25cm以下土层则因土质紧密,空气量不足,养分与水分缺乏,含菌量也逐步减少.因此,采土样最好的土层是5～25cm.一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个,并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到.如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等.但总的说来酵母菌分布土层最浅,约5～10cm,霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层.
2. 土壤酸碱度和植被状况
土壤酸碱度会影响微生物种类的分布.偏碱的土壤(pH7.0～7.5)环境,适合于细菌、放线菌生长.反之在偏酸的土壤(pH7.0以下)环境下,霉菌、酵母菌生长旺盛.由于植物根部的分泌物有所不同,因此,植被对微生物分布也有一定的影响.如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌.葡萄或其他果树在果实成熟时,其根部附近土壤中酵母菌数量增多.豆科植物的植被下,根瘤菌数量比其他植被下占优势.
3. 地理条件
南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多,特别是热带和亚热带地区的土壤.许多工业微生物菌种,如抗生素产生菌,尤其是霉菌、酵母菌,大多从南方土壤中筛选出来.原因是南方温度高,温暖季节长,雨水多,相对湿度高,植物种类多,植被覆盖面大,土壤有机质丰富,造成得天独厚的微生物生长环境.
4. 季节条件
不同季节微生物数量有明显的变化,冬季温度低,气候干燥,微生物生长缓慢,数量最少.到了春天随着气温的升高,微生物生长旺盛,数量逐渐增加.但就南方来说,春季往往雨水多,土壤含水量高,通气不良,即使有微生物所需的温度、湿度,也不利于其生长繁殖.随后经过夏季到秋季,约有7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下,土壤中微生物数量比任何时候都多,因此,秋季采土样最为理想.
(二)采样方法
用取样铲,将表层5cm左右的浮土除去,取5～25处的土样10～25,装入事先准备好的塑料袋内扎好.北方土壤干燥,可在10～30处取样.给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件.一般样品取回后应马上分离,以免微生物死亡.但有时样品较多,或到外地取样,路途遥远,难以做到及时分离,则可事先用选择性培养基做好试管斜面,随身带走.到一处将取好的土样混匀,取3～4撒到试管斜面上,这样可避免菌株因不能及时分离而死亡.
二、根据微生物生理特点采样
1. 根据微生物营养类型
每种微生物对碳氮源的需求不一样,分布也有差异.研究表明,微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性.如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等,富含纤维素,适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长;在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中,由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在,因而,在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌;在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所,容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株.若要筛选以糖质为原料的酵母菌,通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样.在筛选果胶酶产生菌时,由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶,因此,从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好.若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物,从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品,容易得到满意的结果.在油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株.Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌.含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性.也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的３株石油降解菌菌株,分别为动胶菌属(Zoogloea sp.)、氮单胞菌属(Azomonas sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.).当然,也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集,然后分离筛选.
此外,不少微生物对碳源的利用是不完全专一的,如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得能源而生长.以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物,也可以利用一些糖类为碳源.具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在.不过数量较少.
2. 根据微生物的生理特性
在筛选一些具有特殊性质的微生物时,需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样.如筛选高温酶产生菌时,通常到温度较高的南方,或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品;分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方,如南北极地区、冰窖、深海中采样;分离耐压菌则通常到海洋底部采样.因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压,如从海中筛到一株水活微球菌(Micrococcus aquivivus),它能在600个大气压下生长.分离耐高渗透压酵母菌时,由于其偏爱糖分高、酸性的环境,一般在土壤中分布很少,因此,通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样.如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌.
三、特殊环境下采样
1. 局部环境条件的影响
值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外,还要受局部环境条件的影响.如北方气候寒冷,年平均温度低,高温微生物相对较少.但在该地区的温泉或堆肥中,却会出现为数众多的高温微生物.氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长,实际上也有一些嫌气菌生活,原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气,为嫌气菌创造了局部生长的有利环境,故一般土壤中也能分离到嫌气菌.
海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境,尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来,但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件,使海洋微生物具备特殊的生理活性,相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物.前苏联学者发现,20%～50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物.此外,美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质.日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌,80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA,最高产量可达36%和24%.笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌,产EPA14.78mg/L,在15℃培养时EPA占脂肪酸的 12.7%.日本也从海洋Thraustochvtrium aureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株.从海洋中采样时,可参考其中不同种类微生物的分布规律:表层多为好气异养菌,底层由于有机质丰富,硫化氢含量高,厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多,两层中则多为紫硫菌.
具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中.如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的,能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物,其原因是这里生活这2000万只蝙蝠,它们每晚吃钓5万lb(磅)昆虫,其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层,这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用.还有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物.从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌,这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物,给该种微生物创造了一个适宜的生长环境.美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌,该菌以木质素为唯一碳源,它对处理过的花生壳的消化率可达到63%,再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%,可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂.
2. 极端环境条件的影响
微生物一般在中温、中性pH条件下生长.但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下,也有少数微生物存在,这类微生物被称为极端微生物.生活所处的特殊环境,导致它们具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能,因而在冶金、采矿及生产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值.
嗜冷菌(thermophiles)的最适生长温度为15℃,在0℃也可生长繁殖,最高温度不超过20℃.主要分布于寒冷的环境中,如南北两极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温环境中.这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染.最适生长pH在8.0以上,通常在 pH9～10之间的微生物,称之为嗜碱菌(alkaliphiles).大量不同类型的嗜碱菌已经从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到.由于大部分碱湖伴有高盐,许多嗜碱菌同时也是嗜盐菌.该类菌所产生的酶如耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶可作为洗涤剂的舔加成分,也可将碱性淀粉酶用于纺织品工业.嗜碱菌中的基因还可以用来调节其他细菌中基因产物的表达和分泌.嗜热微生物是嗜热菌最好的来源.有人从温泉和海底火山口分离出了极端嗜热菌.从意大利境内的喷硫磺气的火山口中分离到一种原始的微生物,在pH2和90℃时生长最好,其代谢类型极不寻常,既能作为耗氧型自养菌将硫氧化成硫酸,使自己增殖,又能作为厌氧菌用氢还原硫,生成H2S.
