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血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四条沟和两条嵴,中央有一短横沟和两个平台,两嵴的表比两平台的表面高0.1 mm,每个平台上刻有不同规格的格网,中央0.1 m㎡面积上刻有400个小方格.通过油镜观察,统计一定大格内微生物的数量,即可算出1毫升菌液中所含的菌体数.这种方法简便,直观,快捷,但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数,并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数.
2、染色
计数法:
为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数,而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足,人们发明了染色计数法.借助不同的染料对菌体进行适当的染色,可以更方便的在显微镜下进行活菌计数.如酵母活细胞计数可用美蓝染色液,染色后在显微镜下观察,活细胞为无色,而死细胞为蓝色.
3、比例计数法:
将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合,在显微镜视野中数出各自的数目,即可得未知菌液的细胞浓度.这种计数方法比较粗放.并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准.
4、液体稀释法:
对未知菌样做连续十倍系列稀释,根据估计数,从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样,接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中,经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数,然后查最大或然数表MPN(most probably number)得出菌样的含菌数,根据样品稀释倍数计算出活菌含量.该法常用于食品中微生物的检测,例如饮用水和牛奶的微生物限量检查.
5、平板菌落计数法:
这是一种最常用的活菌计数法.将待测菌液进行梯度稀释,取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合,或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上.保温培养后,用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度,即可算出原菌液的含菌数.一般以直径9cm的平板上出现 50-500个菌落为宜.但方法比较麻烦,操作者需有熟练的技术.平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数,而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养,获得了单克隆.
6、试剂纸法:
在平板计数法的基础上,发展了小型商品化产品以供快速计数用.形式有小型厚滤纸片,琼脂片等.在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基,其中加入活性指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养.短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量.试剂纸法计数快捷准确,相比而言避免了平板计数法的人为操作误差.
7、膜过滤法:
用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品,经丫叮橙染色,在紫外显微镜下观察细胞的荧光,活细胞会发橙色荧光,而死细胞则发绿色荧光.
8、生理指标法:
微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化,例如酸碱度,发酵液中的含氮量,含糖量,产气量等,与生长量相平行的生理指标很多,它们可作为生长测定的相对值.
9、测定含氮量:
大多数细菌的含氮量为干重的12.5%,酵母为7.5%,霉菌为6.0%.根据含氮量×6.25,即可测定粗蛋白的含量.含氮量的测定方法有很多,如用硫酸,过氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas测N2气法.Dumas测N2气法是将样品与CuO混合,在CO2气流中加热后产生氮气,收集在呼吸计中,用KOH吸去CO2后即可测出N2的量.
10、测定含碳量:
将少量(干重0.2-2.0mg)生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加热30分钟后冷却.加水稀释至5毫升,在580nm的波长下读取吸光光度值,即可推算出生长量.需用试剂做空白对照,用标准样品做标准曲线.
11、还原糖测定法:
还原糖通常是指单糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况,常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测.方法是,离心发酵液,取上清液,加入斐林试剂,沸水浴煮沸3分钟,取出加少许盐酸酸化,加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液,继续加Na2S2O3至终点,查表读出还原糖的含量.
12、氨基氮的测定:
方法是:离心发酵液,取上清液,加入甲基红和盐酸作指示剂,加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去,加入底物18%的中性甲醛,反应数刻,加入0.02N的使之变色,根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量.根据培养液中氨基氮的含量,可间接反映微生物的生长状况.
13、其他生理物质的测定:
P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸,产气,产CO2(用标记葡萄糖做基质),耗氧,黏度,产热等指标,都可用于生长量的测定.也可以根据反应前后的基质浓度变化,最终产气量,微生物活性三方面的测定反映微生物的生长.如我所在BMP-2的发酵生产上,随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化,判断细菌的长势.
