通常第一维电泳是等电聚焦,在细管中（φ1～3 mm）中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离.而后将凝胶从管中取出,用含有SDS的缓冲液处理30 min,使SDS与蛋白质充分结合.

    将处理过的凝胶条放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上,加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接.在第二维电泳过程中,结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS－聚丙烯酰胺凝胶,在浓缩胶中被浓缩,在分离胶中依据其分子量大小被分离.

    这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上.细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000～2000个蛋白质,有些报道可以分辨出5000～10000个斑点,这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近.由于二维电泳具有很高的分辨率,它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白.