按细胞比重分离B细胞

1．将2～3ml含3×107纯化的B细胞（B细胞>90％）的细胞悬液加到3ml Percoll溶液（比重1.074）上，水平离心1000×g 20分钟。

2．吸去无细胞上清液，交界面的低密度B细胞和大部分Percoll溶液。由于此时细胞沉淀非常松散，需留下约0.2ml Percoll溶液以防吸去了沉淀细胞。轻敲离心管，用留下的液体悬浮高密度B细胞。

3．用洗涤液分别洗涤低密度B细胞和高密度B细胞两次，每次离心500×g 10分钟。最后，测定细胞数和细胞活力，用1～2ml含5％小牛血清的洗涤液将细胞配成适当浓度。

用尼龙毛法分离B细胞

1）尼龙毛柱的制备

1．取直接3D，长度约10cm的尼龙毛，用0.2mol/L HCl浸泡处理过夜。用双蒸水洗净HCl，置37℃烘干备用。

2．称取50mg尼龙毛，均匀分散，置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夹住。将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高约5～6cm。此柱可分离约2×107细胞。将柱置－20℃可保存2～3个月。

2）分离细胞

1．取分离的单个核细胞，用细胞培养液将细胞配成2×107/0.5ml。

2．融化尼龙毛柱，以每分钟5～7滴的速度放出Hanks液，并用5ml预温至37℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。小心将细胞悬液加入尼龙毛柱中，待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后，立即加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管。

3．在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中静置1小时。用5ml预温至37℃的细胞培养液洗脱细胞。洗脱液中含有纯的T细胞。再用5ml预温至37℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱，洗净不粘附的细胞。

4．加入0.5ml细胞培养液，夹住塑料管，将尼龙毛柱置冰箱中冷却。用4℃预冷的细胞培养液分3～4次洗脱尼龙毛柱，每次0.5ml。可先夹住塑料管，用玻璃棒或金属丝反复挤压尼龙毛以利粘附细胞脱落，然后再洗脱。洗脱液中含有大量B细胞。离心1000×g 10分钟，去上清液，用细胞培养液同样洗涤细胞1次。计数细胞，用细胞培养液将细胞配成适当浓度。