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简易过碘酸钠法制备HRP结合物

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-06-27

  本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。

  1. 原理:经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。

  2. 标记步骤:
  (1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
  (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。
  (3) 将上述溶液装入透析袋中,对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜。
  (4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗体,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时。
  (5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。
  (6) 将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS透析,4℃过夜。
  其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。

  3. 结果判定:
  除标记物IgG量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。
  IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

  4. 试剂及器材:
  (1) 0.1M NaIO4:称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂,批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
  (2) 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:
  0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
  0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
  加蒸馏水至2,000ml。
  (3) 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:
       Na2CO3 0.32克
       NaHCO3 0.586克
       加蒸馏水至50ml
  再用蒸馏水作20倍稀释,即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。

  (4) NaBH4溶液(4mg/ml):
  临用时称取NaBH44mg溶于1ml蒸馏水中。

  (5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。

 
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