在生物体内胆甾醇从乙酰辅酶A生物合成。三分子乙酰CoA（C₂）缩合，经由乙酰乙酰CoA（C₄）而成为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，它的硫酯基被还原而生成甲羟戊酸（C₆）。由于甲羟戊酸的磷酸化和随后发生的脱羧和脱水而生成异戊烯焦磷酸（C₅）和二甲基丙烯焦磷酸（C₅）。后二者，顺次结合而生成牻牛儿醇焦磷酸（C₁₀）。继而变成法尼焦磷酸（C₁₅），二分子法尼焦磷酸结合而成〔角〕鲨烯（squalene）（C₃₀），〔角〕鲨烯氧化性闭环成为羊毛甾醇（C₃₀）。最后，在羊毛甾醇的4和14位上的3个甲基脱掉，Δ²⁴的双键饱和以及Δ⁸双键向Δ⁶位移动而得到胆甾醇。结果胆甾醇的27个碳原子都是来自醋酸（15个来自醋酸的甲基碳素，12个来自羧基碳素）。几乎所有的组织都可从醋酸合成胆甾醇。参与胆甾醇合成的酶都含于微粒体中，细胞的可溶性部分存在着促进因子，C₂₈及C₂₉甾体生物合成最初也经历着和胆甾醇一样的途径，形成甾体核，以后，在侧链24位上引入来自蛋氨酸甲基的碳原子。