序列测定(sequencing)已有50多年的历史，但开始时进展十分缓慢。最初，人们致力于建立蛋白质(proteins)和多肽(peptides)的分离技术，并确定其氨基酸(amino acids)种类及含量。1945以前，没有任何蛋白质序列定量测定的方法。以后十年中，随着色谱技术和标记方法的快速进展，第一个多肽激素(胰岛素)的全序列测定于1955年完成(Ryle等，1955)。五年后，第一个酶(核糖核酸酶)序列测定完成(Hirs等，1960年)。1965年，约有20个含100多个残基的蛋白质序列被确定。截止1980年，这一数字已达1500个。而今天，已测定的蛋白质序列已达30万个，这在50年前是难以想象的。
最初，蛋白质序列测定主要采用手工的埃德曼降解和环甲基化(Edman deglation - dansylation)方法(Edman，1950年)。蛋白质序列测定的快速进展，应该归功于自动测序仪的研制成功。与埃德曼和贝格(Begg) 于1967年发明的测序法相比，1980年开始使用的自动测序仪的灵敏度提高了近1万倍。
质谱技术的发展为蛋白质序列测定开辟了新的途径。第一次用这种方法测定完整的蛋白质分子是在1997年。质谱法测序的突出优点是可以识别翻译后修饰 (post-translations modification) 而得到的特殊氨基酸。用其它方法进行蛋白质序列测定时，这种修饰信息无法获得。正是利用了质谱技术，人们得出了 g-氨基丁酸处于凝血素N-末端的重要结论。