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决定显微镜拍摄荧光照片质量的因素主要取决于像的衬度和像的亮度, 像的衬度是由样品中激发出的荧光与背景上观察到的光之比决定的。背景光包括透过截止激发光的滤色片的杂散激发光, 样品组织成分的自发荧光和光学系统的自发荧光和杂散光, 在荧光显微术中尽全力要解决的是既获得最佳的像衬度, 同时又维持像有足够亮度, 这两者往往是矛盾的。例如用极窄波带滤色片激发时仅利用了极少的光能, 背景暗了但荧光亮度也弱了。在应用时, 只能兼顾, 合理的权衡以决定取舍。
荧光显微光学系统需要优先考虑的是:
(1) 光学系统组成的材料应选用在激发光波内无荧光材料, 不但指光学系统玻璃也包括胶合制造中的胶合剂、切片、盖玻片和浸液以及密封剂。若有自发荧光, 不但会增加背景光, 有时还会混淆观察荧光图像。
(2) 光学系统的参数选择中, 应将获得最大光能作为第一考虑因素。
照明系统中集光镜应选用最大的包容角; 采用柯勒照明并使灯丝或弧光像充满入瞳, 以期望获得高效率的均匀照明。
收集荧光成像的物镜, 因为像面照度与数值孔径NA 2 成正式, 为此作为荧光用物镜应有较大的NA值。目前10×已达015; 20×达0175; 40×达019; 油镜40×达113。
双目镜筒作为荧光用时应在可见光谱段有较高的透过率, 采用镀膜技术可大大地减少光能的损失, 它可比一般双目镜筒透射率提高一倍, 这对弱荧光物质观察是必须的。
目镜放大率不宜选大, 因为象面照度与目镜放大率平方成反比。若其它条件相同, 当用613×目镜时,照度定为100% , 换上1215×时, 照度约为25% , 因此常在4×～ 613×之间选用。
由此表明, 用不同物镜和目镜组合成同一倍率的显微镜时, 象面照度和曝光系数可相差数倍, 对于荧光观察最佳组合是选用低倍率目镜和NA 大的物镜最为合适。
(3) 作为荧光光学系统各组成部件的光谱特性也是至关重要的, 特别是紫外光要通过的部件, 如照明系统, 聚光镜以及物镜, 要关注紫光区的透射系数。聚光镜要选用透紫外线的材料。照明系统中反光镜表面镀铝比镀银好, 因为铝在UV 和V 区反射率在90% 以上, 而银仅达70%。加拿大胶吸收紫外线, 在紫外区通过处不宜用作胶合剂。
