3、提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于RNA二结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二结构，从而使引物可以结合。

4、促进逆转录的添加剂
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到*链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二结构，多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20％的甘油而不降低活性。

5、RNaseH处理
在PCR之使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，在cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。