手机版
1 流式细胞仪的概念及其发展历史
1.1 流式细胞仪的基本概念
流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。
1.2 流式细胞仪的发展简史
最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。
2 流式细胞仪的工作原理和技术指标
2.1 流式细胞仪工作原理
除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。
除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。
2.1.1 信号的产生、转换和传输
在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室，形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射光和荧光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，因此被称为细胞的物理参数或固有参数。散射光又包括前向角散射和测向角散射。前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。荧光信号也有二种；一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
在压力作用下，鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室，形成一股稳定地连续的液流，保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上，并以单个细胞形式直线通过激光照射区。激光照射区又称测量区，是指液流与激光束垂直相交的点。当细胞携带荧光素标记物通过激光照射区时，产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360°立体角发射，产生散射光和荧光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术，因此被称为细胞的物理参数或固有参数。散射光又包括前向角散射和测向角散射。前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关，测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。荧光信号也有二种；一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光信号，另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光信号。在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜，或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。最常用的光电转换器是光电倍增管（PMT）。从PMT输出的电信号需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞仪中一般备有两类放大器。一类是线性放大器，其输出信号与输入信号成线性关系。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号，如DNA测量等。另一类是对数放大器，其输出信号和输入信号之间成常用对数关系。在免疫学测量中常使用对数放大器。放大后的电信号被传送到计算机，再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件，保存在计算机上。保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析。
2.1.2 流式细胞仪分选原理
并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要求进行适当调整。
并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成均匀的小液滴。根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中。使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，可根据具体要求进行适当调整。
2.1.3 数据的显示和分析
数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图。横座标X是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”（Channel No．）来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。
数据处理主要包括数据的显示和分析。单参数直方图是使用最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析。单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图。横座标X是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”（Channel No．）来表示。选择的放大器类型不同，标度不同。纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目。正常情况下，数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图。对曲线图的解释应该具体问题具体分析。
除直方图外，数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等。二维点图也是比较常用的数据显示类型。它显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，也是二维平面图，横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定，点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值。二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图。
数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类。当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法。非参数分析法不用对显示的图像做任何假设，也不采用数学模型，分析程序可以很简单，也可能很复杂。临床医学较常使用非参数分析法。
2.2 流式细胞仪性能的技术指标
流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV值）来表示。现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于2.0%。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力。一般用荧光微球上可测出的FITC的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml。分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目。一般分析速度为5000～10000，分选速度控制在1000以下。
流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等。荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离，通常用变异系数（CV值）来表示。现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于2.0%。荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力。一般用荧光微球上可测出的FITC的最少分子数来表示。目前仪器均可达到1000左右。仪器工作时样品浓度一般在105～107细胞/ml。分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目。一般分析速度为5000～10000，分选速度控制在1000以下。
流式细胞仪测量的数据是相对值，因此需要在使用前对系统进行校准或标定。流式细胞仪的校准有二个目的，即仪器的准直调整和定量标度。通常使用标准微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。
