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琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。
1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
① DNA分子的大小 在凝胶中，DNA段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。
② 琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
表 琼脂糖浓度与DNA分离范围
| 琼脂糖浓度/％ | 0.3 | 0.6 | 0.7 | 0.9 | 1.2 | 1.5 | 2.0 |
| 线状DNA大小/kb | 60－5 | 20－1 | 10－0.8 | 7－0.5 | 6－0.4 | 4－0.2 | 3－0.1 |
2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。
