1. 准备 NZY agar plates（至少用前 24 小时倒好） ，用前在37℃培养箱中烘烤1-2 小时以去除水滴。

2. 将过夜培养的 XL1-blueMRF' 细菌 2000 转/ 分，离心10 分钟，将细菌溶解在10mMMgSO4 中，调整细菌浓度为 OD600=0.5。

3. 融化 NZY top，并将 NZY top 放在 50℃水浴中。

4. 将适量的 XL1-blueMRF' 细菌溶液与一定稀释度的 phage 文库混合，37℃下共同作用 15 分钟。

① 直径 90mm 平板：200μl XL1-blue 细菌+适量的 phage文库

② 直径 150mm 平板：600μl XL1-blue 细菌+适量的 phag 文库

（噬菌斑数量一般保持在 3000pfu/90mm;12000pfu/150mm）

5. 将步骤 4 中的混合液与 NZY top 溶液混合（200μl 混合液+3-4mlNZY top 溶液；600μl 混合液+8-10 ml NZY top 溶液） ，倒入到 NZYagar plates中，室温 下放 10 分钟左右，然后倒置放于 37℃下培养。

6. 当噬菌斑刚好可看到时（大约 5-8 小时） ，从培养箱中拿出平板。

7. 将 NC 放入 10mMIPTG溶液中完全浸湿，在空中使膜沥干，并做好 3 个不对称的标记。

8. 将 IPTG 处理好的 NC 贴在平板上，不留气泡，然后倒置放于 37℃下培养。

9. 过夜培养后，第二天早上取出平板，用镊子将膜轻轻掀起，注意不要将培养基粘在膜上。

10. 将膜放于 50mlTBST 溶液中，水平脱色摇床上震荡洗膜 3 次，每次10 分钟。

11. 将膜放入 50ml 封闭液中，水平摇动，封闭 4-6 小时。

12. 在封闭液中加入适当滴度的一抗，水平摇动处理过夜。

13. 将膜放于 50mlTBST 溶液中，洗膜 3 次，每次 10 分钟。

14. 在封闭液中加入适当滴度的二抗（各个公司的二抗使用滴度不同），室温水平摇动 1-2 小时。

15. 将膜放于 50mlTBST 溶液中，洗膜 3 次，每次10 分钟，最后用 50mlTBS溶液洗膜 15-20 分钟，取出膜空气中沥干。

16. 将膜放入 BCIP-NBT 显色液中避光显色，水平摇动直到阳性斑点可见为止。

17. 从显色液中取出膜放在 TBS溶液中，空气中使膜干燥。

18. 根据所做的标记，将膜与平板对齐，将平板上对应的阳性克隆区域的培养基挖出放入 500μl SM buffer中，并加入 25 ml chloroform，4℃贮存 （最多可贮6月）。

19. 第一轮筛选得到阳性克隆需要进行第二轮筛选以去除假阳性并获得阳性单克隆噬菌体。过程如第一轮筛选，只不过用直径90mm 平板；具体过程见步骤 4， 这时所加入的噬菌体溶液是第一轮筛选得到的噬菌体上清 （见步18骤），

在用前要滴定好噬菌体的滴度，噬菌斑的数量以可区分出单个克隆，同时密 度不能太稀为标准（一般 100-200 pfu/90mm） 。

20. 按第一轮相似的过程进行实验，最后显色，确定真正的阳性克隆，并将阳性单克隆所在的培养基挖出放入 500μl SM buffer 中，并加入 25 ml chloroform，4℃贮存（最多可贮存 6 月） 。

注意：

1. 封闭液一般可用：5%的脱脂牛奶或 1%的 BSA 溶解在 TBST溶液中。

2. 第一轮筛选用 150mm 的平板；第二轮筛选用 90mm 的平板，一般需要筛选 至少 1 x 106 pfu。

3. 认真做好三个不对称的标记，特别在第二轮挑选阳性克隆时要仔细将膜与平 板吻合好，不能挑错。